檢測認證人脈交流通訊錄
- 樣品制備:
牛奶不需要處理;肉、魚、蝦等需均質、提取、離心、稀釋。
標本的稀釋原則:
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內,檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中,應做好詳細的記錄。最后計算濃度時,稀釋了“N”倍,標本的濃度應再乘以“N”。
標準品的稀釋原則:2瓶,每瓶濃度為500 ng/ml,以樣品稀釋液做系列倍比稀釋,分別稀釋500 ng/ml,250 ng/ml, 125 ng/ml,62.5 ng/ml,31.2 ng/ml,15.6 ng/ml,7.8 ng/ml。樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml。
辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物的稀釋原則:
臨用前以辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物稀釋液稀釋,稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔50ul),實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物加990ul辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內配制。
操作步驟
實驗開始前,請提前配置好所有試劑,試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul,余孔分別加標準品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,然后在所有孔中加入50 ul辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物工作液。盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應30分鐘-1小時。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 溫育后,棄去孔內液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。
3. 依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色(30分鐘內,此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
4. 依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(此時藍色立轉黃色)。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。
5. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。
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