方案優(yōu)勢

方法的定量下限(S/N=10)分別為0.06、0.8、0.5 mg·kg-1，加標(biāo)回收率為90.2％～97.7％，變異系數(shù)（CV）不大于7.9％

采用標(biāo)準(zhǔn)

相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

方法/原理/步驟

　　實驗試劑

　　甲醇、乙腈，均為色譜純，德國CNW技術(shù)有限公司；乙酸銨、乙酸，色譜純，ACS美國恩科公司生產(chǎn)；水為實驗用三級水。

　　多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品、甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)品、百菌清標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

　　弗洛里硅土SPE柱、C18SPE柱、中性氧化鋁SPE柱，均為500 mg/6mL，德國Simon Aldrich公司生產(chǎn)。

　　色譜條件

　　色譜柱，Agilent Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5μm)，美國安捷倫科技有限公司。流動相：A為10 mmol·L-1乙酸銨水溶液(用乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5)，B為甲醇；檢測波長：240 nm，270 nm；柱溫：40℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10μL。梯度洗脫程序如表1所示。

　　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

　　精密稱取多菌靈、甲基托布津和百菌清標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配制成濃度為1mg.mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。取適量的標(biāo)準(zhǔn)貯備液用甲醇配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

　　樣品的處理

　　取代表性樣品約10 g，將其剪碎至2 mm×2 mm以下，混勻。準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.001 g)試樣，置于50 mL有蓋離心管中，加入20 mL乙腈，超聲提取30 min，提取液過濾于圓底燒瓶中，殘渣再用10 mL乙腈重復(fù)提取一次，過濾。提取液合并后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5 mL，轉(zhuǎn)入預(yù)先用乙酸乙酯活化的弗羅里硅土SPE小柱中。再用5 mL乙腈溶液洗滌圓底燒瓶，合并洗滌液加入硅土柱中，然后用5 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1)淋洗小柱兩次，收集流出液經(jīng)40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇溶解并定容至1 mL，經(jīng)0.45μm的有機系微孔濾膜過濾，供液相色譜檢測。

　　樣品凈化條件的選擇

　　皮革樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾成分較多，提取溶液需要經(jīng)過有效凈化，避免干擾測定。本實驗采用固相萃取技術(shù)對樣品提取液進行凈化，分別考察了中性氧化鋁柱、弗洛里硅土柱、C18柱這三種SPE小柱的凈化效果，其中弗洛里硅土柱效果最佳；乙腈-乙酸乙酯混合洗脫劑對三種目標(biāo)物在弗洛里硅土小柱上的洗脫能力優(yōu)于乙腈、乙酸乙酯、甲醇等單一溶劑，對多菌靈、甲基托布津和百菌清的回收率都達到90%以上。

　　樣品提取條件的選擇

　　甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等溶劑均能提取多菌靈、甲基托布津和百菌清。經(jīng)實驗比較，乙腈同時提取皮革樣品中的多菌靈、甲基托布津和百菌清效果最好。所以本實驗采用乙腈作為提取溶劑。

　　色譜條件的優(yōu)化

　　紫外檢測波長的選擇

　　用多菌靈、甲基托布津和百菌清的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行紫外光譜掃描，掃描范圍200~800 nm。多菌靈在235 nm和275 nm都有較強的紫外吸收，甲基托布津在229 nm和267 nm有較強的紫外吸收，百菌清在240 nm處有很強的紫外吸收。為保證三種待測物均有較好的響應(yīng)值，選取240 nm作為百菌清的檢測波長，選取270 nm作為多菌靈和甲基托布津的檢測波長。DAD光譜圖見圖1、圖2和圖3。

    色譜柱與流動相的選擇

　　C18液相色譜柱對多菌靈、甲基托布津和百菌清均有較好的保留，可用作液相色譜分析柱。本文選用Agilent Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5μm)色譜柱進行分析。考察了甲醇-水(體積比20∶80)等度洗脫，多菌靈和甲基托布津保留值低，出峰快，均在3分鐘之內(nèi)出峰，兩種物質(zhì)分離不好，易受雜質(zhì)干擾。實驗比較了甲醇-水和甲醇-乙酸銨水溶液兩種流動相體系對多菌靈、甲基托布津和百菌清保留時間的影響，發(fā)現(xiàn)在甲醇-乙酸銨水溶液流動相中，多菌靈的保留時間由水-甲醇流動相的2.6 min變?yōu)?.5 min；甲基托布津由2.9 min變?yōu)?4.5 min；百菌清由4.7 min變?yōu)?2.3 min。因此本文選用“1.2”的甲醇-乙酸銨水溶液梯度洗脫程序作為流動相體系，能夠更好地將3種目標(biāo)物質(zhì)有效地分離，提高色譜柱對目標(biāo)物質(zhì)的保留，避免雜質(zhì)峰的干擾，適合皮革類復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測。多菌靈、百菌清和甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見圖4和圖5。

　　線性范圍、檢出限與定量下限

　　準(zhǔn)確配制濃度為0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、15 mg·L-1的多菌靈、甲基托布津和百菌清的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)測定5次，以平均色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算相關(guān)系數(shù)。多菌靈、甲基托布津和百菌清的線性關(guān)系見表2，多菌靈、百菌清和甲基托布津定量下限LOQ(S/N=10)分別為0.06 mg·L-1、0.8 mg·L-1、0.5 mg·L-1。多菌靈、百菌清和甲基托布津的檢測限LOD(S/N=3)分別為0.02 mg·L-1、0.24 mg·L-1、0.15 mg·L-1。

　　回收率與精密度

　　在空白的皮革樣品中添加多菌靈、百菌清和甲基托布津標(biāo)樣，使樣品中多菌靈、百菌清和甲基托布津的添加水平分別為1.0、5.0和10.0 mg/kg，每個加標(biāo)水平做6個回收實驗，平均回收率和變異系數(shù)(CV)見表3。空白皮革樣品中加標(biāo)色譜圖見圖6和圖7。

儀器設(shè)備

Agilent 1200 液相色譜儀

安捷倫1200系列快速高分離液相色譜系統(tǒng)，系統(tǒng)配置靈活，可以使用二元、三元和四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)。在分辨率、靈敏度和精確度不變的前提下，分析速度是常規(guī)高效液相色譜儀的20倍、分辨率提高了60%。