方案優(yōu)勢(shì)

采用70% 乙醇溶液超聲波浸提法可成功從荔枝果皮中提取到根皮苷，用高效液相色譜—質(zhì)譜可高效快速地檢測(cè)出其中含量。

采用標(biāo)準(zhǔn)

相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

方法/原理/步驟

　　材料和試劑

　　D101大孔樹(shù)脂(天津南開(kāi)和成公司)。根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度≥99.0%。流動(dòng)相所用甲醇為色譜純( Dikma公司)，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。其余試劑均為分析純。荔枝品種為桂味，采自廣州增城船坑果園。

　　實(shí)驗(yàn)方法

　　1.標(biāo)準(zhǔn)品配制：

　　精密稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品0.0050g，溶于甲醇中，配制濃度0.02 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使用時(shí)稀釋成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。標(biāo)準(zhǔn)品溶液4℃避光保存。

　　2.樣品前處理:

　　新鮮荔枝果皮(連衣)陰干后，粉碎過(guò)40目篩。準(zhǔn)確稱取荔枝皮粉末10.0 g，加入70%乙醇150 mL，超聲處理30 min，功率100%。過(guò)濾后重復(fù)提取一次，合并濾液。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至70 mL，加入180 mL無(wú)水乙醇靜置過(guò)夜，濾過(guò)，減壓濃縮至醇全部揮發(fā)，加入純水150 mL超聲輔助溶解，抽濾，得到粗提液。

　　粗提液上樣至經(jīng)處理的大孔樹(shù)脂柱20 mL，上樣速度1 mL·min-1，然后用純水淋洗至無(wú)色(共450mL純水)。再用70%乙醇50mL解吸附，流速1mL·min-1，洗脫液4℃避光保存，得到荔枝皮提取液。

　　3.固相萃取:

　　取荔枝皮提取液5mL通過(guò)活化后的固相萃取小柱(活化固相萃取小柱先用10mL甲醇通過(guò)小柱，再以10mL純水洗去甲醇，速度均為1 mL·min-1)，速度1mL·min-1，前3 mL流出液棄去，余流出液經(jīng)0.45μm微孔濾膜后作高效液相色譜檢測(cè)。

　　4.高效液相色譜測(cè)定條件:

　　以甲醇-0.1%乙酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前研究結(jié)果改良)，甲醇(A) -0.1%乙酸(B，V∶V，pH=3.20)，0～20 min，45%～60% A。進(jìn)樣量:10μL;柱溫: 40℃;檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm。

　　5.質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定:

　　采用電噴霧電離源(ESI)，殼氣流速15單位，噴霧電壓3kV，毛細(xì)管電壓18V，毛細(xì)管溫度200℃，選擇離子掃描，質(zhì)量數(shù)掃描范圍434.50～435.50m/z。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　1.HPLC系統(tǒng)適用性調(diào)試結(jié)果：

　　分別對(duì)研究分析所用HPLC系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)試，根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在7.2 min位置出峰;荔枝皮樣品溶液也在此位置上出現(xiàn)目標(biāo)組分峰，參見(jiàn)圖。處理計(jì)算后知:根皮苷保留時(shí)間tR= 7.22min。其與周圍可能存在的干擾物分離良好，分離度約為1。

HPLC 圖譜

??? 2.MS系統(tǒng)實(shí)用性

　　分別對(duì)研究分析所用MS系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)試，根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在7.9 min位置出峰;荔枝皮樣品溶液也在8.0 min位置上出現(xiàn)目標(biāo)組分峰，參見(jiàn)圖2。處理計(jì)算后知:根皮苷保留時(shí)間tR = 8.0 min。其與周圍可能存在的干擾物分離良好。

HPLC-MS 圖譜

　　3.標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　將根皮苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液梯度稀釋為0.0100、0.005、0.0025、0.00125、0.000625、0.000312 5 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，在已確定的高效液相色譜條件下，分別將不同濃度的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量關(guān)系進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 0.0275X + 0.0739，線性范圍0.000312 5～0.010g·L-1，相關(guān)系數(shù)(R2)0.9992，表明線性關(guān)系良好，能滿足定量分析的要求。

　　4.方法檢測(cè)限和定量限

　　以信躁比S/N=3來(lái)估算檢測(cè)限，根皮苷的檢測(cè)限為0.302 mg·L-1，信噪比S/N =10計(jì)算出定量限為0.906 mg·L-13.

　　5.精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

　　精密吸取濃度為0.005 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積的RSD為0.26%。

　　精密稱取荔枝皮粉末10.0 g，共6份，制備供試品溶液的方法制備溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得根皮苷含量的RSD為1.84%，表明在該色譜條件下儀器精密度良好。

　　6.加樣回收率試驗(yàn)

　　精密稱取荔枝皮粉末10.0g，共9份，分別精密加入低( 0.00125g·L-1 )、中(0.005 g·L-1 )、高(0.0100g·L-1 )濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 mL，分別制備供試品溶液的方法制備溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得平均回收率為99.0%，RSD為1.26%(n=9)。

　　7.若干實(shí)際樣品測(cè)試檢測(cè)結(jié)果

　　精密稱取荔枝皮粉末10.0 g，共5份，制備供試品溶液的方法制備溶液，進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，分別為0.001 901、0.001 773、0.001 886、0.001 616和0.001762 g·L-1,平均含量0.001788g·L-1。

儀器設(shè)備

高效液相色譜儀

高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。