方案優勢

該方法準確、靈敏、重現性好，并能有效地控制醋氯芬酸腸溶膠囊的質量。

采用標準

相關標準

方法/原理/步驟

　　試藥

　　醋氯芬酸腸溶膠囊(批號：100777-200401，含量：100%)、雙氯芬酸對照品、醋氯酚酸甲酯對照品、醋氯酚酸乙酯對照品、醋氯酚酸芐酯對照品、雙氯芬酸甲酯對照品、雙氯芬酸乙酯對照品、雙氯芬酸芐酯對照品、醋酸醋氯芬乙酸對照品、吲哚醋氯酚酸對照品、醋酸醋氯芬酸對照品(LGC GmbH Im Biotechnologiepark, D-14943 Lucknwalck, Germany)

　　甲醇、乙腈均為色譜純，水為三次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

　　溶液制備

　　對照品溶液：精密稱取各雜質對照品各12.20mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得。

　　供試品溶液：精密稱取腸溶膠囊適量，用甲醇溶解并稀釋成每1mL約含1mg醋氯芬酸的溶液。搖勻，濾過，即得。

　　專屬性試驗

　　取輔料，按處方配比，制成不含主藥醋氯芬酸的空白溶劑，超聲取上清液，作為供試品溶液，精密量取20μL注入液相色譜儀，色譜圖見圖1，實驗結果表明，輔料不干擾本品的測定。稱取醋氯芬酸腸溶膠囊適量(約40mg)5份，另取等量的空白輔料作為平行對照，分別置于10mL容量瓶中，經光(4500lx，5天)、酸(0.09 mol/L鹽酸，5min)、堿(0.05mol/L氫氧化鈉，5min)、高溫(120℃，5h)、氧化(30%H2O2溶液，4h)5種破壞試驗，其中醋氯芬酸腸溶膠囊經強光、高溫、強氧化未產生新的雜質，經酸堿破壞雜質A、雜質B、雜質I三種已知雜質含量變大，而空白輔料均未產生破壞雜質，色譜圖見圖1，結果表明本色譜條件可使醋氯芬酸與其他降解產物達到有效地分離，且與相鄰雜質峰的分離度良好，符合要求。

　　線性范圍

　　精密量取標準貯備液適量，用甲醇稀釋制成系列濃度溶液。分別進樣測定，記錄色譜圖。以各自峰面積A為縱坐標、濃度c為橫坐標，進行線性回歸，并以信噪比(S/N)=3計算各溶劑的最低檢測限，結果可見，各物質在相應的濃度范圍內線性關系良好。

　　精密度試驗

　　精密量取對照品溶液，連續測定6次，測得各溶劑峰面積的RSD分別為1.5%、1.4%、1.04%、0.23%、0.6%、0.8%、1.3%。

　　回收率試驗

　　分別配制低(80%)、中(100%)、高(120%)3種不同濃度的對照品溶液，以對照品溶液作對照。精密稱取供試品適量，分別加入上述不同濃度的對照溶液適量，溶解制成0.1 g/ml的溶液，搖勻，共9份。在上述色譜條件下進行測定，得平均回收率(n=3)：雜質A 98.8%、雜質B99.2%、雜質C100.2%、、雜質D99.6%、、雜質E102.3%、雜質F100.7%、雜質G99.1%、雜質H100.9%、雜質I99.5%、醋氯芬酸100.7%、

　　穩定性試驗

　　配置標準對照溶液，在上述色譜條件下分別于0h，2h，4h，6h，8h進行測定，記錄色譜圖，測得各溶劑峰面積的RSD分別為1.1%、1.7%、0.9%、1.2%、0.8%、1.2%、1.5%。

　　醋氯芬酸腸溶膠囊有關物質分析

　　取供試品溶液，在上述色譜條件下進行進樣分析，譜圖見圖2，采用外標法，與標準對照溶液各雜質峰面積進行比較，從而測得樣品各雜質含量見下表。

儀器設備

　　儀器

　　LCMS-2010EV高效液相色譜儀(日本島津公司)；LC-MS solution液相色譜工作站(日本島津公司)Thermo BDS HYPERSIL C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)。

　　色譜條件與系統適用性試驗

　　色譜柱: Thermo BDS HYPERSIL C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)；流動相A為20mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(用12g/L的氫氧化鈉溶液調pH=7.00)；流動相B為甲醇-乙腈(1:1)；檢測波長為275 nm;柱溫為40℃；流速為1.0ml/min；進樣量20μL。梯度程序如下

　　表1 梯度洗脫程序

結果與討論

　　結果

　　表醋氯芬酸膠囊樣品測定結果

　　討論

　　檢測波長的選擇

　　本實驗利用二極管陣列檢測器對醋氯芬酸對照品、樣品及雜質對照品在全波長范圍內進行光譜掃描，發現醋氯芬酸在275nm處有最大吸收，且在此波長處，其他雜質也有較好地吸收，故選擇了275nm作為含量測定和有關物質檢查的檢測波長。

　　流動相A pH的選擇

　　本實驗考察了不同pH的磷酸鹽緩沖液時的色譜效果，結果顯示當pH太小時，醋氯芬酸與雜質A重合，這可能是由于醋氯芬酸發生了水解；當pH太大時，峰形變差，最終選擇pH=7.0時，主峰與各雜質峰基本達到分離。

　　流動相B的選擇

　　本實驗考察了甲醇，乙腈，甲醇-乙腈對分離效果的影響，結果顯示流動相B單獨使用甲醇或乙腈時，主峰與相鄰雜質峰的分離度太小，且主峰拖尾嚴重，選用三元混合體系更有利于調節離子強度，通過考察不同比例的甲醇-乙腈，發現當其比例為1∶1時，保留時間、峰形和分離效果好。梯度程序的選擇醋氯芬酸及其9個雜質的結構及性質差別較大，采用等度洗脫模式只能檢測到9個色譜峰，雜質B和D重疊，并且檢測時間要到90分鐘，因此采用提多洗脫模式，既可以實現10各組分的基線分離，并且對于破會后的新雜質也不影響測定，分析時間縮短一倍。醋氯芬酸的結構不穩定，容易降解，并且原料中的副產物較多，該方法非常適合與醋氯芬酸及其制劑中雜質的檢查。