方案優勢

用HPLC-ELSD法對復方甘草酸銨注射液中未衍生的甘氨酸、鹽酸半胱氨酸進行直接測定，結果較滿意。

采用標準

現行標準中采用容量法分別測定鹽酸半胱氨酸與甘氨酸含量，但在實際檢驗中，該方法操作繁瑣，干擾因素多，誤差較大。現在氨基酸的含量一般都采用柱前衍生化RP-HPLC法測定心引，由于柱前衍生化反應溶液量較少，試劑容易揮發，衍生化時間較長，致使試驗條件不易控制；同時衍生物是否具有足夠的穩定性也需要考察，這些因素的限制使該法不利于直接、快速測定氨基酸。

方法/原理/步驟

　　測試過程：

　　色譜條件

　　C18—ODL色譜柱(4.6 mm×250mm，5μm)；流動相A(乙腈)-B(5.0 mmol/L七氟丁酸的0.7%三氟醋酸溶液)，流動相A與流動相B梯度洗脫(0-5 min，0：100；5-10 min，15：85；10-25 min，35：65)；ELSD漂移管溫度80℃(氮氣流量2.0 L·min-1，流速0.8 mL·min-1，柱溫35℃，進樣量10μL，理論塔板數按甘氨酸峰計不低于3000。

　　對照品溶液制備

　　分別精密稱取經五氧化二磷減壓干燥24 h的甘氨酸對照品97.15mg、鹽酸半胱氨酸對照品7.72mg，置10mL量瓶中，加0.01mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1mL置10mL量瓶中，加0.01mol/L。鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含甘氨酸0.9715g/L、鹽酸半胱氨酸0.0772g/L的對照品溶液。

　　供試品溶液制備

　　取本品1mL，移置20mL量瓶中，加0.01 mol/L。1鹽酸稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，備用。

　　陰性樣品溶液制備

　　取缺甘氨酸、鹽酸半胱氨酸的樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

　　空白試驗

　　為進一步確定方法的可行性，取陰性樣品溶液，依法測定，結果陰性樣品溶液色譜在與混合對照品峰相應的保留時間處無色譜峰，表明無干擾，色譜圖見圖1。

　　圖1復方甘草酸銨注射液HPLC色譜

　　線性關系考察

　　分別取上述對照品溶液5，10，15，20，25，30μL進樣，按上文的條件與方法進樣測定，以對照品的6個進樣量對數值x為橫坐標，以峰面積對數值y為縱坐標，進行線性回歸，甘氨酸回歸方程為y=1.351X+4.272(r=0.997 5)，線性范圍4.858～29.145μg；鹽酸半胱氨酸回歸方程為y=1.723X+8.911(r=0.995 2)，線性范圍0.386～2.316μg。

　　精密度試驗取對照品溶液，重復進樣5次，測定峰面積，甘氨酸RSD 1.97%，鹽酸半胱氨酸RSD 1.04%。

　　穩定性試驗

　　取同一批供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，8，12 h測峰面積，甘氨酸峰面積12 h內RSD 2.53%，鹽酸半胱氨酸峰面積12 h內RsD 2.21%，說明甘氨酸與鹽酸半胱氨酸在0.01 m01.L“鹽酸中穩定。

　　重復性試驗

　　取同一批樣品5份，制成供試品溶液，分別測定峰面積，利用標準曲線計算，甘氨酸與鹽酸半胱氨酸RSD分別為1.95%，2.07%。

　　回收率試驗

　　取已知含量的樣品(批號11041802，甘氨酸19.81 g·L～、鹽酸半胱氨酸1.466g·L。1)6份，每份0.5 mL，分別移置20 mL量瓶中，每份各精密加入對照品溶液1 mL(濃度為甘氨酸9.826 g·L～，鹽酸半胱氨酸0.747 g·L)，制成供試品溶液，分別測定。計算回收率，結果甘氨酸與鹽酸半胱氨酸平均回收率分別為97.43%，96.99%；RSD分別為1.61%，1.89%。見表1～2。

　　表1 氨酸加樣回收率試驗

　　表2 鹽酸半胱氨酸加樣回收率試驗

　　樣品含量測定取復方甘草酸銨注射液3批(11041802，11041803，11041804)，制成供試品溶液，分別測定。計算含量，結果3個批號的樣品含甘氨酸分別為19.81，19.49，19.58 g/L，含鹽酸半胱氨酸分別為1.466，1.471，1.449 g/L。

儀器設備

　　儀器與試藥

　　蘭博series 4060高效液相色譜儀

　　另外還有蘭博蒸發光散射檢測器(Ezchrom色譜管理軟件，美國lanbo公司)，電子天平，真空恒溫干燥箱，自動雙重純水蒸餾器。甘氨酸對照品、鹽酸半胱氨酸對照品；三氟乙酸七氟丁酸，色譜純乙腈，重蒸餾水，其余試劑為分析純。復方甘草酸銨注射液、缺甘氨酸、鹽酸半胱氨酸樣品。

討論:

　　方甘草酸銨注射液質量標準H1規定用氯化溴滴定法測定鹽酸半胱氨酸含量，試驗要求加入1mol/L的鹽酸2 mL，靜置后生成白色沉淀，此凝乳狀沉淀使溶液黏稠，導致下一步過濾困難。亞硫酸鈉若去除不徹底，也會干擾檢驗結果，實踐中發現用該法含量測定結果偏高。

　　大部分氨基酸分子中無共軛結構，無紫外吸收或較弱，所以不能直接用紫外檢測器檢測，只能通過適當衍生化后產生有紫外吸收的衍生物，方可用紫外檢測器或熒光檢測器檢測哺。現在常用的氨基酸柱前衍生法根據衍生化試劑不同有PITC法、AQC法、OPA.FMOc法和DNFB等法。這些方法本身要求反應選擇性強、定量進行，衍生物有足夠的穩定性，但筆者通過試驗發現的OPA-半胱氨酸和DNFB-半胱氨酸衍生物均不穩定，使用這兩種方法測半胱氨酸含量時誤差較大。采用蒸發光散射檢測器檢測則可省去衍生化這一步驟，試驗時間大大縮短。

　　ELSD檢測器作為一種準通用型檢測器，僅對不揮發被分析物產生信號，其信號響應值僅取決于被分析物質顆粒的大小和數量，而不需考慮有無紫外吸收的問題，該檢測方法對流動相的變化不敏感，即使在梯度洗脫時基線也很平穩。通過調節ELsD檢測器的漂移管溫度與載氣流速，可以使基線噪音最小，響應值相對最高，從而獲得很好的色譜圖。本研究中考察了漂移管溫度70，80，90℃，氣體流速1.8，2.0，2.2 L/min。1條件下的色譜情況，結果選定漂移管溫度80℃，氣體流速2.0 L/min。為試驗條件，該條件下基線平穩，噪音小，被測成分均有適宜的響應值。

　　氨基酸在水溶液中為強電解質，在極性溶劑中溶解度較大，在極性較弱的c18柱上保留時間非常短。七氟丁酸可與氨基酸分子形成離子對，抑制了氨基酸的解離，適當延長了保留時間，改善了峰型。本研究采用乙腈5.0 mmol/L的七氟丁酸-0.7%三氟乙酸系統，甘氨酸和半胱氨酸分離完全，色譜峰型對稱性好、峰形尖銳，保留時間適當。試驗全過程操作簡便，結果準確、可靠，可用于該制劑的質量控制。