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SYTO 9培養條件和細菌懸液的制備

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　　SYTO 9培養條件和細菌懸液的制備　　SYTO 9/PI 活細菌/死細菌雙染試劑盒　　一、培養條件和細菌懸液的制備：　　【注意】：用本試劑盒進行細菌染色，務必要小心去除培養基殘留，因為，核酸和其它培養基成分可能以不可預料的方式與SYTO 9和PI結合，導致染色結果發生不可接受的變動。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養基內含的培養基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。　　1.1 用營養肉湯培養大腸桿菌或Staphylococcus aureus（30ml）使其生長至對數生長后期。　　1.2 于10000×g離心10-15min，濃縮25ml細菌培養物。　　1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或適當緩沖液來重懸沉淀。　　1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當緩沖液的30-40ml離心管（設置為活細菌組），用含20ml 70%異丙醇（也可以用其他方法比如高熱處理殺死細菌）的30-40ml離心管（設置為死細菌組）。　　1.5 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。　　1.6 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于10000×g離心10-15min。　　1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。　　1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當緩沖液重懸兩管樣品。　　1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）。　　1.10 對于大腸桿菌或Staphylococcus aureus的建議染色濃度，根據你的儀器類型（熒光顯微鏡、熒光光度經、熒光酶標儀）或流式細胞儀來參考相應部分的染色條件。　　二、染色條件的優化：　　試劑盒內的兩種染料都經過平衡優化，按照1：1的比例進行混合用于絕大多數的樣本都能得到良好的區分活/死細菌。偶然情況下，兩種染料的混合比例需根據實際需求進行優化調整。比如：在待檢樣本中，綠色熒光太突出，建議要么降低SYTO 9濃度，要么提高PI濃度。　　為了全面優化染色條件，建議測試梯度濃度的SYTO 9，每一種濃度與梯度濃度的PI進行組合染色。建議按照1ml細菌懸液加入3?l不同混合比率的染料預混液。　　[注]：SYTO 9 +PI 對細菌的染色請按照說明書建議的15min來操作，不要超過30min。 SYTO 9有很好的細菌滲透性，我們給的實驗條件都是優化過。 SYTO 9只有在哺乳動物細胞染色，可能會延長染色時間到120min。　　由于染的是活菌+死菌的比例，請染色后盡快觀察，不要超過1h。另，染色后基本是不用清洗的，除非覺得背景熒光很高，就是非細菌的菌體部分都能看到熒光，才有必要簡單清洗一次。　　http://www.shujibio.com/Products-38611237.html 　　https://www.chem17.com/st326659/product_38611237.html

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